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PCR技術的原理與方法
編輯:雁楓 [ 2012-8-21 15:37:04 ] 文章來源:教育裝備在線
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PCR定義
PCR(Polymerase Chain Reaction)即聚合酶鏈式反應,是指在DNA聚合酶催化下,以母鏈DNA為模板,以特定引物為延伸起點,通過變性、退火、延伸等步驟,體外復制出與母鏈模板DNA互補的子鏈DNA的過程。是一項DNA體外合成放大技術,能快速特異地在體外擴增任何目的DNA。可用于基因分離克隆,序列分析,基因表達調控,基因多態性研究等許多方面。

PCR技術的基本原理
一.PCR反應成分:
1.模板DNA;2.引物;3.四種脫氧核糖核苷酸;
4.DNA聚合酶;5.反應緩沖液、Mg2 等。
二.PCR反應基本步驟:
1.變性:高溫使雙鏈DNA解離形成單鏈(94℃,30s)。
2.退火:低溫下,引物與模板DNA互補區結合(55℃,30s)。
3.延伸:中溫延伸。DNA聚合酶催化以引物為起始點的DNA鏈延伸反應(70~72℃,30~60s)

1.變性(denaturation):通過加熱使模板DNA的雙鏈之間的氫鍵斷裂,雙鏈分開而成單鏈的過程。
2.退火(annealling):當溫度降低時,引物與模板DNA中互補區域結合成雜交分子。
3.延伸(extension):在DNA聚合酶、dNTPs、 Mg2 存在下,DNA聚合酶催化引物按5’→3’方向延伸,合成出與模板DNA鏈互補的DNA子鏈。
以上述三個步驟為一個循環,每一循環的產物均可作為下一個循環的模板,經過n次循環后,目的DNA以2n的形式增加。

PCR擴增的基本方法


•PCR反應的成分和作用
總體積:一般為25μl~100 μl
(一)無Mg2 buffer:由純水、kcl、Tris組成。Tris用于調節反應體系pH值,使Taq酶在偏堿性環境中反揮活性。kcl可降低退火溫度,但不能超過50 mmol/L,否則會抑制DNA聚合酶活性。
(二)Mg2 :終濃度為1.5~2.0mmol/L,其對應dNTP為200 μmol/L,注意Mg2 與dNTPs之間的濃度關系,由于dNTP與Taq酶竟爭Mg2 ,當dNTP濃度達到1 mmol/L時會抑制Taq酶的活性。 Mg2 能影響反應的特異性和產率。
(三)BSA:一般用乙酰化的BSA,起著減少PCR管對Taq酶的吸附作用,對Taq酶有保護作用。
(四)底物(dNTPs):dNTPs具有較強酸性,其儲存液用NaOH調pH值至7.0~7.5,一般存儲濃度為 10 mmol/L,各成份以等當量配制,反應終濃度為20~200μmol/L。高濃度可加速反應,但同時增加錯誤摻入和實驗成本;低濃度可提高精確性,而反應速度會降低。
(五)Taq酶:能耐95℃高溫而不失活,其最適pH值為8.3~8.5,最適溫度為75~80℃,一般用72℃。能催化以DNA單鏈為模板,以堿基互補原則為基礎,按5’→3’方向逐個將dNTP分子連接到引物的3’端,合成一條與模板DNA互補的新的DNA子鏈。無3’→5’的外切酶活性,沒有校正功能。某種dNTP或Mg2 濃度過高,會增加其錯配率。用量一般為0.5~5個單位/100μl。
(六)模板:PCR對模板DNA的純度不要求很高,但應盡量不含有對PCR反應有抑制作用的雜質存在,如蛋白酶、核酸酶、TqaDNA聚合酶抑制劑、能與DNA結合的蛋白質。
模板DNA的量不能太高,否則擴增可能不會成功,在此情況下可適當稀釋模板。
(七)引物:引物濃度一般為0.1~0.5μmol/L,濃度過高會引起錯配和非特異擴增,濃度過低則得不到產物或產量過低。引物長度一般15~30個堿基,引物過長或過短都會降低特異性。其3’末端一定要與模板DNA配對,末位堿基最好選用A、C、G(因T錯配也能引發鏈的延伸)。
引物G C約占45~55%,堿基應盡量隨機分布,避免嘧啶或嘌呤堆積,兩引物之間不應有互補鏈存在,不能與非目的擴增區有同源性。

•PCR反應條件的選擇(影響因素)
•溫度參數:
1.變性:模板變性完全與否是PCR成功的關鍵,一般先于94℃(或95℃)變性3~10min,接著94℃變性30~60s。
2.退火:退火溫度一般低于引物本身變性溫度5℃。引物長度在15~25bp可通過公Tm=(G C)×4℃ (A T)×2℃計算退火溫度,一般退火溫度在40~60℃之間,時間為30~45s。如果(G C)低于50%,退火溫度應低于55℃。較高的退火溫度可提高反應的特異性。

3.延伸:延伸溫度應在Taq酶的最適溫度范圍之內,一般在70~75℃。延伸時間要根據DNA聚合酶的延伸速度和目的擴增片段的長度確定,通常對于1kb以內的片段1min是夠用的。
循環數:
PCR的循環數主要由模板DNA的量決定,一般20~30次循環數較合適,過多的循環數會增加非特異擴增產物,具體要多少循環數可通過預試驗確定。
PCR產物積累規律:
反應初期產物以2n呈指數形式增加,至一定的循環數后,引物、模板、DNA聚合酶形成一種平衡,產物進入一個緩慢增長時期(“停滯效應”),即“平臺期”。到達平臺期所需PCR循環數與模板量、PCR擴增效率、聚合酶種類、非特異產物竟爭有關。 
 

PCR擴增儀

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